一、简介

 

流式细胞术（FC）是一项技术，旨在对细胞或微粒集合的物理及化学属性进行识别和定量分析。在这一过程中，含细胞或微粒的样本被悬浮于液体中，并引入至流式细胞分析仪中。此时，样本在流动中被集束成细流，以便单个细胞能够逐一穿过激光束。激光束与细胞相互作用时产生的散射光量度了细胞及其组成部分的特性。通常，细胞会被特定的荧光染料标记，这样它们在吸收光能后能以特定的波长范围重新发射光能。此技术能够迅速地分析成千上万个细胞，并通过计算机程序对收集到的数据进行处理。
 

二、应用

1.医学应用：

HIV感染者的免疫状态评估：通过CD4细胞的绝对计数来评估免疫功能。

 

白血病与淋巴瘤的分类诊断：通过免疫表型的分析。

 

肿瘤生物学特征的分析：进行细胞周期及染色体倍性分析。

 

血红蛋白合成障碍症的诊断：通过计算网织红细胞数量。

 

细胞移植前后的匹配与免疫监测：用于交叉配型和监测免疫状态。

 

干细胞研究与应用：包括干细胞的数量评估。

 

最小残留病检测：用于白血病治疗后的监控。

 

HLA-B27基因型的检测：与某些自身免疫疾病相关。

 

血小板功能异常及相关疾病的诊断。

 

2.科研应用：

 

免疫学研究：识别具有特定表面标记的细胞群体，以及分析细胞表面与外源性分子的相互作用。

 

神经科学：研究神经干细胞和前体细胞的特性，以及不同神经细胞类型的功能和状态。

 

肿瘤学研究：评估化疗和放疗对肿瘤的影响，并监测治疗效果。

 

细胞和分子生物学：分析细胞周期的不同阶段和进行多参数细胞分析。

 

高通量筛选和药物开发：研究细胞功能的变化，用于新药的开发和筛选。

 

海洋生物学：用于收集和分析海洋微生物，如细菌、藻类和浮游生物。

 

微生物学：检测细菌、酵母和荧光蛋白。

 

生物燃料研究：提升生物燃料的生产和效率。

 

遗传学：通过测定染色体DNA含量来分析染色体的分布情况。

 

三、实验原理

 

流式细胞术（FCM）代表了一种综合利用多项技术的先进生物医学分析方法，其整合了激光技术、光电检测技术、计算机处理、流体动力学、细胞免疫荧光化学以及单克隆抗体技术，形成了一门跨学科的高科技细胞分析领域。该技术通过将单个细胞或微粒悬浮在液体中并引导它们单一通过聚焦的激光光束，可以精确地收集散射光和荧光信号，从而实现对细胞或微粒的多参数分析。这些参数包括但不限于粒子的形状和大小、细胞周期阶段、细胞内因子、表面抗原以及DNA含量等。

 

流式细胞术不仅能够提供有关活细胞的详尽信息，包括基于荧光标记物的强度和颜色以及散射光强度的生物特性，而且还能执行细胞分选任务。这意味着基于特定特征，如表面标记或细胞活性，可以从混合细胞群中精确分离出特定细胞群。此外，如果分选过程在无菌条件下完成，这些分选后的细胞还可以用于进一步的培养和研究，扩大了流式细胞术在生物医学研究和临床诊断中的应用范围。

 

四、实验方法

 

Step1：制成单细胞悬液（组织样本）

Step2：溶血（细胞样本无需进行此步骤）

Step3：离心去上清

Step4：调整细胞密度

Step5：加入相应的标记抗体

Step6：孵育

Step7：洗涤后离心去上清

Step8：上机检测

五、案例展示

 

 

六、常见问题

 

1.样本量与处理时限：需准备至少1毫升的样本，并在收集后6小时内进行处理，以避免细胞活性下降或其他变化。不适宜使用被冷冻保存的样本或是经历溶血的样本，因为这些条件可能影响细胞的物理状态和荧光特性。

 

2.细胞活性的重要性：确保待测细胞保持高活性，低活性细胞可能导致非特异性荧光染色，影响结果的准确性。

 

3.细胞浓度调整：在样本上机前，细胞浓度应调整至1×10^6细胞/毫升。浓度过低会直接影响到检测结果的准确性和可靠性。

 

4.仪器状态的优化：操作流式细胞仪时，需确保仪器处于最佳工作状态，通过使用标准样品调校，将变异系数控制在最低，保持分辨率在最佳水平，以避免仪器状态变化导致的测量误差。

 

5.细胞凋亡与坏死的区分：在进行细胞凋亡与坏死分析时，可以在红色与蓝色荧光散点图上观察到细胞由凋亡区向坏死区的迁移轨迹，这一现象通常与凋亡细胞DNA的进一步降解有关。

 

6.Hoechst 33342染色时间控制：使用Hoechst 33342与细胞孵育时，孵育时间应控制在20分钟以内。过长的孵育时间可能会引起Hoechst 33342发射光谱从蓝光向红光的转移，导致红色与蓝色荧光比例的变化，进而影响分析结果的判断。
 

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