一、什么是qPCR

 

定量聚合酶链式反应（qPCR）是分子生物学领域的一项创新技术，取得了良好的精确性和准确性，已经深刻改变了生物医学研究的面貌。

 

作为经典PCR技术的高级形式，qPCR，亦称实时定量PCR，利用特定染料在新合成的DNA链中的荧光信号，或者利用针对特定DNA序列的探针的片段，来监测DNA的互补过程这种技术的核心优势在于，它能够将DNA的检测和扩增过程相结合，从而能够即时地为科研工作者提供重要的数据信息。

 

在其基本操作原理上，qPCR与传统PCR技术相似，通过DNA聚合酶催化DNA的补充，将新的标记序列添加到短的单链DNA片段上，即引物的3'-OH断裂，以这一系列反应在配备有荧光检测设备的特制热循环仪内进行，通过测量荧光信号强度，将其与预定的参考值相比较，实现DNA含量的相对或绝对定量。

 

二、qPCR常见应用

 

实时监测、高灵敏度和特异性使 qPCR 能够精确测量遗传物质，并使 qPCR 在各种应用中具有不可估量的价值。

 

主要应用于：

基因表达谱分析

病原体检测

遗传变异研究

环境监测

临床诊断

 

 

三、qPCR 的工作原理是什么

 

典型的 qPCR 反应开始于含有 DNA 聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTP）、引物、染料或报告基因和模板 DNA 的混合母液。

 

 

四、qPCR 的关键步骤

 

变性阶段：在高温环境中（通常在94至98°C之间），双链DNA解开成多余单链。

 

初步阶段：在温度稍低的环境中（大约在50至70°C之间），使引物与特定的模板DNA目标区域相结合。

 

延伸阶段：DNA 聚合酶通过向引物 （68-72°C） 中添加核苷酸来产生两条互补的 DNA 链

 

定量完成阶段：在每一轮DNA补充时，利用荧光计测量并记录荧光信号，以定量分析。

 

 

五、qPCR 检测方法

 

常见的qPCR检测方法包括DNA插层染料、水解探针、分子信标和LNA探针。

 

检测方法	优点和缺点	描述
DNA插层染料 (SYBR® 绿色)	染料用途广泛且具有成本效益，但特异性低。	与DNA非特异性结合 与新合成的 DNA 嵌入后发出可检测的荧光
水解探头 (TaqMan™  探头)	探针具有高度特异性，但需要精确和定制的设计。	靶标特异性寡核苷酸，5'端有荧光报告基因，3'端有淬灭剂，它们保持紧密接近，使得荧光团保持猝灭状态   DNA聚合酶的5'核酸外切酶活性切割报告基因，将其与淬灭剂分离并发出荧光
分子信标	虽然用途广泛且具有特殊性，但这些设计可能很复杂。	发夹形探针，一端为荧光基团，另一端为淬灭剂 与靶标结合后，环伸直，将淬灭剂与发射荧光的报告基因分离
锁定核酸 （LNA） 探针	虽然它们的特异性和热稳定性确保了测量的精度，但设计这些探头通常需要大量的优化。	使用带有锁定核糖环的修饰核苷酸的探针，可提高探针-靶标杂交体的热稳定性
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六、qPCR引物设计的关键考虑因素

 

引物长度宜在15至30个碱基对之间，这有利于针对70至200个碱基对的目标序列进行高效互补。

 

选用的正反引物应有接近的熔解温度（Tm），理想目标温度为60至65°C。

 

引物的3'端应充足GC，这有助于提高模板结合的效率和提升熔解温度。引物的GC含量应控制在40%至60%之间，以保证梯度、稳定性以及梯度效率的最优化。

 

设定的退火温度应比引物的Tm低约5°C，这样做是为了减少非极化的可能性。

 

 

七、常见问题及解决方法

 

1.qPCR 扩增效率低

 

问题原因：

1.试剂和反应体系问题：可能由于试剂降解或反应体系加液量不足而导致效率低。

 

2.设计问题：引物和标志设计存在缺陷，可能导致产物长度过长或反应条件须充分优化。

 

解决方法：

1.保证所使用的试剂质量良好，并按照标准程序正确加样。

 

2.参考文献或借助专业软件，重新设计引物和标记，以确保产物长度控制在80到150碱基对之间，同时优化反应条件。

 

2.结果出现假阳性功能

 

问题原因：

1.试剂和反应体系问题：可能是由于试剂或模板受到污染，或者检测中镁离子浓度过高、引物浓度过高等原因导致。

 

2.设计问题：引物设计存在缺陷，可能导致引物之间的二聚体和发夹结构的形成，影响PCR后续的反应的进行。

 

解决方法：

1.严格遵守实验操作规程，人群小心操作试剂或模板的污染。

 

2.一旦发现污染情况，及时确定污染源并进行处理，必要时需更换接受污染的试剂或模板。

 

3.引物设计完成后，使用专业软件验证引物，确保避免引物之间的二聚体和发夹结构的形成。

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