Transwell迁移/侵袭实验

简介：

细胞迁移是指细胞在外界信号的作用下从一个位置（区域）移动到另一个位置（区域）的过程，这个过程在生物体内发挥着非常重要的生理和病理学作用，比如损伤修复、肿瘤转移、免疫细胞的迁移、组织修复等。
肿瘤细胞的侵袭性是肿瘤学研究中的一个关键度量标准，用于评估与肿瘤相关的信号通路、药物治疗、靶向疗法以及致癌/抑癌基因的效果。因此，在肿瘤研究中，通常需要进行肿瘤细胞侵袭能力的测试。其中，Transwell实验是一种常见的实验方法，用于评估细胞的迁移和侵袭能力。

基本原理：

Transwell实验的核心原理涉及使用一个培养板，其中包含两室：一个位于上层，另一个位于下层，它们之间由聚碳酸酯膜隔开。上室中放置了研究的细胞，而下室则包含下层培养液。这两室之间的聚碳酸酯膜具有一定的通透性，使得下层培养液中的成分可以影响上室内的细胞生长和运动。通过使用不同大小和经过不同处理的聚碳酸酯膜，可以进行多方面的研究，包括细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移以及细胞侵袭等。

材料与仪器：

显微镜、Transwell 小室、细胞培养板孔板、无血清 DMEM、10% 胎牛血清、DMEM 和 1640 培养基、DMEM 完全培养基、
1640 完全培养基（也可加到 20% 血清）、无菌 PBS、棉签、胰酶、4% 多聚甲醛固定液、结晶紫染液。

实验步骤：

（一）、使用前进行基底膜水化
每孔加 50 μl 无血清培养液，37℃ 室温下 30 min 进行基底膜水化。
（二）、制备细胞悬液
先让细胞撤血清饥饿 12～24 h，进一步去除血清的影响。
消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用 PBS 洗 1～2遍，用含 BSA 的无血清培养基重悬。调整细胞密度至 5×105 个/ml。
（三）、接种细胞
1.取细胞悬液 100 μl 加入 Transwell 小室。
2.孔板下室加入 600 μl 含 10% FBS 的培养基。
3.培养细胞：常规培养 12～48h（主要依细胞迁移能力而定）。
（四）、结果统计
一.直接计数法
a）.“贴壁”细胞计数
这里的“贴壁”指的是，当细胞穿过膜后，它们可以黏附在膜的下层而不会掉入下室。你可以通过对细胞进行染色（例如结晶紫染色、台盼蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色）
来标记它们，然后在显微镜下数计细胞的数量。
    1.细胞固定
使用镊子谨慎地取出小室，吸干上室内的培养基，然后用棉签轻轻擦拭Matrigel和上室内的细胞。接下来，取一个新的24孔板，向其中加入600μL的4%多聚甲醛，并将小室放入
其中以进行固定，固定时间为20-30分钟。
  2.细胞染色
取出小室后，吸去上室内的固定液，然后将小室移至预先加入约800μl 0.1%-0.2%结晶紫染料的孔中。在染液中让细胞染色15-30分钟。随后，去除未与细胞结合的结晶紫，通过轻轻
  用棉签擦拭小室的上侧，去掉那些非特异性地附着在小室上表面的染料，以便在后续的镜检中进行计数。
  3.细胞计数
轻轻用清水多次冲洗，将小室取出后，吸干上室内的液体。然后，使用湿棉棒小心地擦拭上室底部膜表面上的细胞。接下来，小心地使用镊子将膜揭下，确保底面朝上，
然后等待适当的时间使其风干。随后，将膜转移到载玻片上，并使用中性树胶进行封片。然后，在高倍显微镜下观察和拍照，随机选择5个视野（包括上、下、中央、左、右各一个），
并计数呈紫色的阳性细胞，最后统计结果。
b）.“非贴壁”细胞计数
因为一些细胞自身特性或特定膜的性质，有时细胞在穿过膜后无法附着在膜的表面，而是掉入下室。在这种情况下，可以选择两种方法来计数细胞数量：一种方法是收集下室内的培养液，
然后使用流式细胞仪来计数细胞数量；另一种方法是通过直接在显微镜下进行细胞计数。

二、.间接计数法
a).MTT法
噻唑兰（MTT）是一种分子，它可以穿透细胞膜并进入细胞内。在活细胞的线粒体中，琥珀酸脱氢酶能够将外部添加的MTT还原为一种难溶于水的蓝紫色晶体，并将其沉积在细胞内。
这些晶体可以通过二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，然后通过酶联免疫检测仪在波长为490nm的条件下测定其光吸收值，从而间接反映活细胞的数量。这种方法常用于测定生物活性因子的活性、
筛选抗肿瘤药物、进行细胞毒性实验以及评估肿瘤对放射线的敏感性等。
b).结晶紫检测
这种方法的原理与MTT法相似。在细胞染色后，使用3%醋酸进行脱色，将紫色结晶完全洗脱。然后，取得到的洗脱液，并在酶标仪上测量其光密度值（波长为570nm），这个数值间接地反映了细胞的数量。

注意事项：

1.需要特别留意气泡的产生，因为它们会减弱或消失下层培养液的趋化作用。如果出现气泡，应当小心地将小室提起，去除气泡，然后再将小室放回培养板中。
2.常见的培养细胞时间为24小时。在选择时间点时，除了考虑细胞的侵袭能力外，还需要考虑处理因素对细胞数量的影响，这一点不容忽视。
3.在选择Transwell的孔径时，需要考虑实验的目的和实验细胞的大小。如果不涉及研究细胞的运动能力，通常可以选择4μm或3μm的孔径。
4.细胞悬液的制备数量需要适度。如果细胞数量过多，它们将快速穿过膜，使得最后的计数变得困难。另一方面，如果细胞数量太少，可能在检测时间点之前，所有的细胞都已经穿过膜，因此需要确保在收样时，上室内仍然有足够的细胞存在。
5.细胞在小室内的形态可能会呈现非正常贴壁形态，而是呈圆形的、悬浮状态下的形态。不过，它们会聚集成团，这是正常现象（根据经验，需要留意观察）。
6.如果进行细胞侵袭实验，首先需要在第一步将Matrigel基质胶涂抹在板上。
7.在接种细胞时，尽量均匀地添加，建议缓慢沿着壁边缘加入。

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