细胞克隆形成实验

实验原理：

       细胞克隆实验是一种重要的技术方法，用于评估细胞的增殖、侵袭性和对杀伤因素的敏感性等特性。
       当单个细胞在离体条件下连续增殖超过6代，它们的后代形成一个群体，称为细胞集落或克隆。细胞克隆形成率表示细胞在接种后存活并形成克隆的数量，即细胞接种后成功贴壁并展现增殖活力的细胞比例。
       并非所有贴壁的细胞都能成功增殖和形成克隆，只有那些贴壁并且具备增殖活力的细胞才能成功形成克隆。因此，克隆形成率反映了细胞群体的依赖性和增殖能力这两个重要特性。  
 

克隆形成的目的：

       可以使用细胞克隆形成实验来衡量细胞处理后的增殖能力，这是通过观察处理后的细胞在培养板上形成克隆的能力来实现的。此实验还能帮助我们评估不同杀伤因素（如药物或基因）对肿瘤细胞增殖能力和群体依赖性的敏感性。
       能够评估细胞在体内形成肿瘤的潜力。并不是所有癌细胞都具有体内形成肿瘤的能力，但如果细胞在离体条件下表现出强大的克隆形成能力，这可能暗示它们在体内形成肿瘤的潜力更大，因此，这种实验可以看作是一种模拟体内肿瘤形成的离体实验。

克隆形成的方法：

       细胞克隆形成实验可以根据所使用的培养介质的差异分为两种类型：平板克隆和软琼脂克隆。
       1.平板克隆形成（Colony Formation on Solid Media）：这种方法涉及将细胞培养在固体培养基上，通常适用于那些贴壁生长的细胞，其中细胞附着在培养基表面。
       2.软琼脂克隆形成（Soft Agar Colony Formation）：这一技术涉及将细胞混合到琼脂糖中，使细胞在琼脂糖中悬浮，而不是附着在培养基表面。软琼脂克隆形成主要用于研究悬浮生长的肿瘤细胞和转化细胞系。
       下面我们就具体看一下这两种实验技术的具体操作。

实验过程：

（一）、平板克隆实验过程

材料：基础培养基(根据细胞选择适用种类)、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青霉素-链霉素溶液(100X)、多聚甲醛固定、结晶紫染液、 Giemsa染液 。
步骤：
（1）6孔板
         1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)重悬成细胞悬液，并计数。      
         2.细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔)。   
         3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。
         4.克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次。   
         5.每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min。
        6.PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。 注意事项：
        1.每隔3天进行换液，在换液时，缓慢加入培养基，避免吹起细胞。    
        2.染色完成后，务必将染液清洗干净，不要在孔中有残留。
（2）平皿
        1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)中备用。      
        2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。      
        3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。      
        4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。      
       5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分钟。      
       6.去固定液，加适量Giemsa应用染色液染10～30分钟。     
       7.用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
       8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。        
注意事项：
       1.平板克隆形成实验是一种容易操作的方法，特别适用于那些贴壁生长的细胞。这种实验通常在玻璃底或塑料培养皿上进行。
       2.实验的关键成功因素在于细胞悬液的制备和接种密度。细胞悬液必须确保细胞均匀分散，不能有细胞团，而且接种密度不应过高。

数据分析：
        使用显微镜观察阳性克隆，即每个克隆包含超过50个细胞，然后使用相机拍照记录。随后，进行克隆数量的计算，这些克隆的大小通常在0.3到1.0毫米之间，并统计各个克隆的大小。
        例如，在研究某个基因对细胞增殖的影响，如敲低前列腺癌细胞株PC3的TCTN1基因，可以使用显微镜拍摄图像（比例尺为250微米），然后使用相机拍摄照片。结果显示，TCTN1基因的敲低抑制了克隆的形成，减小了克隆的数量和大小。

（二）、软琼脂克隆形成

        软琼脂克隆形成实验，也称为非锚定依赖性生长实验（Anchorage-independent assay），利用软琼脂作为培养介质，促使细胞在悬浮状态下生长。
        某些恶性肿瘤细胞表现出不仅在贴壁状态下能增殖，而且在悬浮状态下也能增殖。这种通过在软琼脂中形成克隆的能力可以反映细胞的恶性程度。软琼脂克隆形成实验可用于深入研究细胞分化的基本原理，同时也可用于评估临床肿瘤治疗的疗效，从而在医学和生物学领域发挥重要作用。     
        具体过程如下图所示：       1.配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固。      
      2.将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固。     
      3.将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次。      
      4.根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色，37°C过夜，拍照。      
      5. 数据分析：显微镜或相机拍照，计算克隆形成率。
      例：通过软琼脂克隆形成实验检测ME2蛋白对神经胶质瘤细胞生长的影响。在神经胶质瘤细胞GBM8401中将ME2蛋白敲低，形成的克隆数减少。
注意事项：
      1.在培养皿中涂覆上层的软琼脂，以确保细胞分散成单个状态；接下来，涂抹下层的软琼脂，起到支撑作用，以防止细胞附着并生长。最后，涂覆一层培养基，以防止琼脂干燥，并为细胞提供所需的养分。如果需要对细胞进行药物处理，药物可以添加到培养基中。
      2.上层软琼脂中的细胞数量会根据不同的细胞类型而有所不同。通常，使用5000个细胞/孔作为起始浓度，但可以根据需要进行调整。
      3.琼脂需要在水浴锅中维持在约42℃左右的温度。如果温度太低，琼脂会凝固，而如果在制备底层琼脂时凝固过快，可能导致不均匀。另一方面，温度过高可能会导致细胞受热而死亡。此外，在实验过程中需要操作迅速，以防止局部结块的发生。
 

结论：

       在选择细胞克隆方法时，关键要考虑实验对象和研究目的。平板克隆适用于检测贴壁肿瘤细胞的增殖能力和致瘤性，而软琼脂克隆形成实验不仅适用于贴壁细胞，还适用于检测悬浮肿瘤细胞和转化细胞系，因此具有平板克隆无法替代的优势。
        如果只需要简单评价贴壁细胞的增殖能力和群体依赖性，那么选择平板克隆就足够了。但如果研究需要更广泛地涵盖悬浮细胞或转化细胞系的特性，那么软琼脂克隆形成实验可能是更好的选择。因此，选择合适的克隆方法要考虑研究的深度和范围。