ELISA实验方法

实验方法：

ELISA的检测方法有直接发、间接法、竞争法基双抗夹心法，其中直接法和竞争法应用较少，应有最多的是双抗夹心法，其在敏感性基因特异性上有明显的优势。

（图片来源于网络）

实验步骤：（双抗夹心法）

操作步骤（图片来源于网络）

材料与仪器：

试剂：血清，血浆，体液碳酸盐包被缓冲液，抗体球蛋白，吐温，柠檬酸；
仪器：硫酸酶标比色计，96 孔板，移液枪，离心管，离心管盒。

步骤：

1、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1~10 ug/ml），每凹孔加 0.3 ml，4 ℃ 过夜，或 37 ℃ 水浴 3 小时，贮存冰箱。
2、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。
3、每凹孔加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37 ℃ 作用 1～2 小时。
4、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。
5、加入 0.2 ml 用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37 ℃ 作用 1～2 小时或由预试实验确定作用时间。
6、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含 0.05% 吐温-20）洗 3 次，每次 5 分钟。
7、加入 0.2 ml 底物溶液于每个凹孔（OPD 或 OT），室温作用 30 分钟（另作一空白对照，0.4 ml 底物加 0.1 ml 终止剂）。
8、加终止剂：每凹孔加 2 M H2SO4 或 2 M 柠檬酸 0.05 ml。
9、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD 用 492 nm）OD 值。

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