凝胶迁移实验（EMSA）

实验原理：

一项研究DNA结合蛋白及其相关结合序列相互作用的技术涉及定性和定量分析。最初设计用于DNA结合蛋白的研究，该技术现已广泛应用于研究RNA结合蛋白与特定RNA序列的相互作用。该研究主要依据DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中呈现不同迁移率的原理。如图1所示，采用生物素或同位素等标记核酸探针，当蛋白质与相应的核酸结合后，在聚丙酰胺凝胶电泳条件下，其迁移速率低于未发生结合的核酸，形成了“滞后”条带（shift band）。

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实验材料：

DNA样品 [γ-32P]ATP T4多聚核苷酸激酶 Nuclease-Free Water T4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵 TE 无水乙醇 TBE buffer 重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过流酸铵 TEMED EMSA Gel-Shift结合缓冲液，溴酚蓝水浴锅 PCR仪离心机电泳仪电泳槽。

实验方法：

一、探针的标记
（1）.如下设置探针标记的反应体系：
1.待标记探针 (1.75 pmol/微升) ：2微升。
2.T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1微升。
3.Nuclease-Free Water ：5微升。
4.[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1微升。
5.T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1微升。
6.总体积 10微升。
按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
（2）.在水浴或PCR仪中进行37℃的反应，持续10分钟。
（3）.加入1微升探针标记终止液，搅拌均匀，终止探针标记反应。
（4）.再加入89微升TE缓冲液，搅拌均匀。此时可以取少量探针进行检测标记效率。通常，标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上被成功标记到了探针上。
为了实验方便，通常不需要测定探针的标记效率。
（5）.标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不应超过3天。已标记好的探针可在-20℃保存。
二、探针的纯化
1、为了实验的方便，通常可以跳过标记好的探针的纯化步骤。然而，在某些情况下，纯化后的探针可能有助于提高EMSA电泳的结果。如需要进行纯化，按照以下步骤操作：对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，然后再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。
2、在-70℃至-80℃条件下沉淀1小时，或在-20℃条件下沉淀过夜。
3、在4℃，以12,000 g至16,000 g的速度离心30分钟。小心去除上清液，切勿触及沉淀。
4、在4℃，以12,000 g至16,000 g的速度离心1分钟。小心吸去残余液体。轻轻晾干沉淀，但避免过度干燥。
5、加入100微升TE缓冲液，完全溶解沉淀。最好立即使用纯化后的标记好的探针，最长使用时间一般不应超过3天。标记好的探针可在-20℃保存。
三、EMSA 胶的配制
1.准备好用于倒胶的模具。可采用传统的用于浇铸蛋白电泳胶的模具，或选择其他合适的型号。最佳选择是使用可浇铸较薄胶的模具，这有助于后续操作，如干燥胶等。为了获得更佳的结果，建议选择可浇铸较大EMSA胶的模具。
2. 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1毫升。重蒸水 16.2毫升。
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2毫升。
（3）80% 甘油： 625微升。
（4）10% 过流酸铵 (ammonium persulfate) ：150微升。
（5）TEMED ：10微升
3.遵循上述步骤逐一加入各种溶液，在加入TEMED之前进行充分混合，加入TEMED后立即迅速搅拌，并立即将混合物注入制胶模具中。在操作中要小心避免产生气泡，并在注入后使用梳齿。如果发现容易形成气泡，可以对制胶的玻璃板进行圭烷化处理。
四、EMSA结合反应
（1）. 如下设置EMSA结合反应
阴性对照反应：
1、Nuclease-Free Water ：7微升。
2、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
3、细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。
4、标记好的探针：1微升。
5、总体积：10微升。
样品反应：
1、Nuclease-Free Water ：5微升。
2、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
3、细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
4、标记好的探针： 1微升。
5、总体积： 10微升。
探针冷竞争反应：
1、Nuclease-Free Water ：4微升。
2、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
3、细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。
4、未标记的探针： 1微升。
5、标记好的探针： 1微升。
6、总体积：10微升。
突变探针的冷竞争反应：
1、Nuclease-Free Water ：4微升。
2、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
3、细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
4、未标记的突变探针： 1微升。
5、标记好的探针： 1微升。
6、体积：10微升
Super-shift反应：
1、Nuclease-Free Water：4微升。
2、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。
3、细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。
4、目的蛋白特异抗体：1微升。
5、标记好的探针：1微升。
6、总体积：10微升。

（2）. 依序加入各种试剂，先在添加标记好的探针之前混匀，然后将混合物放置在室温（20-25℃）下静置10分钟。这个步骤旨在消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针先进行反应。接着，添加标记好的探针并混匀，再将混合物在室温（20-25℃）下静置20分钟。

（3）. 添加1微升无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（10X），混匀后立即进行上样。请注意：在某些情况下，溴酚蓝可能影响蛋白和DNA的结合，因此建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果在使用无色上样缓冲液上样时感觉无法顺利进行，可以向无色上样缓冲液中添加极少量蓝色上样缓冲液，直至能够观察到蓝色为止。
五、电泳分析
1.使用0.5倍的TBE作为电泳缓冲液，并在10V/厘米的电压下进行10分钟的预电泳。在预电泳过程中，若存在未使用的上样孔，可以添加适量稀释后的1倍EMSA上样缓冲液（蓝色）以验证电压是否正常。
2.将混合了上样缓冲液的样品注入上样孔中。在多余的上样孔中添加10微升稀释好的1倍EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），用于监测电泳的进行情况。
3.在10V/厘米的电压下进行电泳。确保胶的温度不超过30℃，如有升温，需适度降低电压。电泳进行至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝达到胶的下缘的1/4位置时，停止电泳。
4.剪取一片大小与EMSA胶相近或稍大的坚固滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，使用吸水纸或普通草纸擦干胶板边缘的电泳液。轻轻打开两块胶板中的上面一块（将滤纸逐渐覆盖整个EMSA胶，轻轻按压滤纸和胶。当滤纸微微湿润（大约不到1分钟）时，轻轻揭起滤纸，此时EMSA胶会随滤纸一起揭起。将滤纸朝下平铺，覆盖一层保鲜膜在EMSA胶的上方，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
5.使用胶干仪器对EMSA胶进行干燥。然后使用X光片进行压片检测，或使用其他适当的仪器设备进行检测。

案例展示：

注意事项：

将纯化的蛋白、细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，然后在非变性的聚丙烯凝胶电泳中分离复合物和未结合的探针。
DNA-复合物或RNA-复合物在电泳中迁移速度较慢，相对于未结合的探针。
同位素标记的探针根据研究的结合蛋白而定，可以是双链或单链。
当检测DNA结合蛋白，如转录调控因子时，可使用纯化蛋白、部分纯化蛋白，或核细胞提取液。
在检测RNA结合蛋白时，根据目标RNA结合蛋白的位置，可使用纯化或部分纯化的蛋白，也可使用核或胞质细胞提取液。
竞争实验采用含有蛋白结合序列的DNA或RNA片段以及特异的寡核苷酸片段，和其他非相关的片段，以确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在存在竞争的特异和非特异片段的情况下，根据复合物的特性和强度确定特异结合。

常见问题：

凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。
在DNA探针的选择上，要考虑的重要因素:目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。
用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物:AP1,AP2,CREB, NFkB，Oct1,Sp1,TFIID. TFIIB。
当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。