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【实验资料】甲基化特异性PCR(MSP)
54 人阅读发布时间：2024-01-09 09:23
甲基化特异性PCR检测
背景简介：
DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控及生理状态密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
胞嘧啶甲基化（图片来源于网络）
近年来，出现了许多用于检测DNA甲基化的技术。其中，亚硫酸氢盐转化法是最常用的甲基化检测方法之一，并衍生出多种变种检测方法。，如：
(1)亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
(2)甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
(3)高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)
(4)甲基化荧光法(MethyLight)
(5)焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)
在这些方法中，甲基化特异性PCR法（MSP）是一种经济实用的选择，无需特殊仪器，因而是目前广泛应用的一种方法。
实验原理：
在PCR反应时,设计两套不同的引物对:
一对引物序列专门针对甲基化DNA链设计，扩增出片段则表明检测位点发生了甲基化（M引物对）;
另一对引物专门针对非甲基化DNA链设计，扩增出片段则表明检测位点没有甲基化（U引物对）。图解示意如下图：
(图片来源于网络)
材料与仪器：
试剂：①0.25% 胰酶、预冷PBS、蛋白酶K、Tris饱和酚（pH 8.0）氯 仿、NaAc (PH 5.2)、无水乙醇、70% 乙醇、TE溶液、细胞裂解液。
②限制性内切核酸酶、DNA片段回收试剂盒、3 mol/LNaOH、20mmol/L对苯 二 酚、NaHSO3溶液(pH 5.0)、8mol/L NH4Ac。
实验步骤：
A.用0.25% 胰酶消化1X106-1X107细胞，用含10% 血清的细胞培养液终止消化，800 r/min室温离心5 min，弃废液。
B.用预冷的细胞培养PBS洗涤细胞沉淀，50000 r/min室温离心5 min，弃废液。再重复洗涤1次后收集细胞沉淀。
C.加入250 µl裂解缓冲液，缓慢混匀，37 ℃孵育20 min。注意事项：混匀注意动作要轻柔。
D.加入适量蛋白酶K，使其终浓度达到100 µg/ml,混匀，55 ℃水浴1 h。
E加入150 µl Tris饱和酚(pH8.0)，混匀后加入等体积(150 µl) 氯 仿 轻柔混匀1 min，12000 r/min室温离心10 min，将上清移至一个新1.5 ml离心管中。注意事项：轻柔混匀；
F.重复步骤E,直至离心后液面间没有蛋白存在（可重复2~3次）。
G.加入250 µl氯 仿，轻柔混匀1 min，12000 r/min室温离心10 min，弃上清。
H.加入0.1倍体积3 mol/L NaAc(PH5.2),混匀后再加入2.2倍体积-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置30 min或过夜。
I.12000 r/min 室温离心10 min,弃上清，加入1 ml预冷的70% 乙醇洗涤2 min。
J. 12000 r/min 室温离心10 min, 弃上清，将残液尽量吸干，室温量干乙醇，再将DNA溶于适量TE或H2O中。
注：细胞裂解液：1 mmol/LEDTA, 10 mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，10 mmol/L NaCl，1% SDS，20 µg/ml RNase A，4 ℃保存。
（二）DNA 的酶切及亚硫酸盐处理
A.用适当的限制性内切核酸酶酶切2 µg基因组DNA(避开需要检测的目的片段），50 µl酶切体系，37 °C过夜。
B用DNA片段回收试剂盒回收酶切的DNA，90 µl H2O洗脱得DNA溶液。
C.加入10 µl新鲜制备的3 mol/L NaOH至终浓度为0.3 mol/L，37℃温育20 min。
D.在上述体系中加入20 mmol/L对苯 二酚30 µl，轻轻颠倒混匀，再加入1040 µl新鲜制备的3.6 mol/L NaHSO3溶液(pH5.0)，轻轻颠倒混匀，离心管外包上铝为纸，避光，并加入200 µl石蜡油，
防止水分蒸发，限制氧化。55 ℃温育10~16 h。注意事项：轻轻颠倒混匀、避光。
E.用DNA片段回收试剂盒回收经亚硫酸盐处理过的DNA(如此时处理过的DNA量过大，也可直接将DNA层析纯化），H2O洗脱得90 µl DNA溶液。
F.在上述体系中加入3 mol/L NaOH 10 µl (终浓度为0.3 mol/L)，37 ℃温育15 min。
G.加入70 µl 8 mol/L NH4Ac中和至pH7.0，加入10 µl糖原(20 mg/ml)，混匀，加入3倍体积(400 µl)的无水乙醇(-20 ℃预冷)，混匀后置于-20 °C 30 min或过夜。
H.12000 r/min室温离心10 min,弃上清，加入1 ml预冷的70% 乙醇洗涤。
I.12000 r/min室温离心10 min，弃上清，将残液尽量吸干。
J.室温晾干乙醇，加入10 µl H2O溶解DNA，-20 °C冻存。
注意事项：
需要参考文献进行相应的操作，以获取可用的大分子基因组DNA。
（特别是在富含多糖和酶类物质的组织中提取基因组DNA时，需考虑去除这些物质，因为它们对后续的酶切、PCR反应等具有较强的抑制作用。）
2.引物的选择和设计至关重要，否则可能导致假阳性结果。不完全的亚硫酸盐处理也容易引起假阳性。
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