原位末端凋亡检测（Tunel）

实验简介：

在细胞凋亡过程中，染色体DNA的断裂经历了多个渐进的阶段。首先，内源性核酸水解酶引发染色体DNA的降解，形成50-300kb的大片段。接着，大约30%的染色体DNA在Ca²+和Mg²+依赖的核酸内切酶的作用下，被随机切断，形成180~200bp核小体DNA多聚体。随后，由于DNA双链断裂或单链缺口，一系列DNA的3’-OH末端可通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的介导，与脱氧核糖核苷酸和其他化合物（如荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素）结合，标记在DNA的3'-末端。这一过程被称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)，可用于检测凋亡细胞。

应用方面：

该技术适用于对用福尔马林固定并石蜡包埋的组织切片、冰冻切片，以及培养或从组织中分离的细胞进行凋亡检测。此外，它还可用于评估抗肿瘤药物的疗效，并通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

实验材料：

组织切片冰冻切片细胞磷酸缓冲液蛋白酶K 氯化估盐蒸馏水 H₂ O₂二氨基联苯丁醇乙醇二甲本甲醛
乙酸松香水抗第高辛抗体氯化钠柠檬酸钠乙酸钠甲基绿 TdT酶反应液光学显微镜染色缸载玻片盖玻片

实验步骤：

1. 标本预处理
（1）对石蜡包埋的组织切片进行预处理的步骤如下：首先，将组织切片放置在染色缸中，通过二甲本进行两次5分钟的洗涤。接着，使用无水乙醇进行两次3分钟的洗涤，随后使用95%和75%乙醇各进行一次3分钟的洗涤。然后，使用PBS进行5分钟的洗涤，随后加入蛋白酶K溶液（浓度为20 ug/ml），在室温下进行15分钟的水解，以去除组织中的蛋白质。最后，使用蒸馏水进行4次2分钟的洗涤，然后按照步骤2进行后续操作。
（2）对冰冻组织切片进行预处理的步骤如下：首先，将冰冻组织切片放置在10%中性甲醛中，在室温下进行10分钟的固定，然后去除多余液体。接着，使用PBS进行两次5分钟的洗涤。将组织切片置于乙醇和乙酸（比例为2：1）的溶液中，在-20℃处理5分钟，然后去除多余液体。再次使用PBS进行两次5分钟的洗涤，随后按照步骤2进行后续操作。
（3）对培养的或从组织中分离的细胞进行预处理的步骤如下：首先，将浓度为约5 × 10^7个/ml的细胞置于4%中性甲醛中，在室温下进行10分钟的固定。然后，在载玻片上滴加50-100 μl的细胞悬液，并使其干燥。接着，使用PBS进行两次5分钟的洗涤，随后按照步骤2进行后续操作。

2. 色缸中加入含2%过氧化氢的PBS，于室温反应5 min。用PBS洗两次，每次5 min。

3. 用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1-5 min。

4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1 h（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5. 将切片放入染色缸中，然后加入已经预热至37℃的洗涤与终止反应缓冲液。在37℃下保温30分钟，每隔10分钟轻轻提起和放下载玻片一次，以轻微搅动液体。

6. 对组织切片进行处理的步骤如下：先使用PBS进行3次5分钟的洗涤，然后直接在切片上滴加两滴标有过氧化物酶的抗第高辛抗体。在湿盒中，让其在室温下反应30分钟。

7. 用PBS洗4次，每次5 min。

8. 在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05% DAB溶液，室温显色3-6 min。

9. 用蒸馏水洗4次，前3次每次1 min，最后1次5 min。

10. 在室温下，使用甲基绿进行10分钟的复染。随后，进行3次蒸馏水洗涤，前两次每次提起放下载玻片10次，最后一次静置30秒。然后，以相同的方式使用100%正丁醇进行三次洗涤。

11. 用二甲本脱水3次，每次2 min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

实验流程

案例展示：

注意事项：

1、必须建立阳性和阴性细胞对照。
2、作为阳性对照的切片可以采用部分被DNaseI降解的标本，阳性细胞对照则可使用经过地塞米松（1 μM）处理3-4小时的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。
3、阴性对照中不添加TdT酶，其余步骤与实验组相同。

常见问题：

一、出现非特异性荧光标记
1、有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。
解决方法是：取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
2、使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。
解决方法： 建议采用推荐的固定液。
3、TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。
  解决方法：注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。
二、荧光背景很高
1、支原体污染。
  解决方法：请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。
2、高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
3、TUNEL反应过强。
  解决方法：可以用试剂盒提供的TdT酶稀释液稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当日使用。
4、红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。
  解决方法： 此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
三、标记效率低
1、使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
2、固定时间过长，导致交联程度过高。
  解决方法：此时宜减少固定时间。
3、荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。
  解决方法：需注意避光操作。
4、碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。
  解决方法：用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。

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资料格式：

原位末端凋亡检测（Tunel）.docx

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【实验资料】Masson染色法

【实验资料】荧光原位杂交技术（FISH）

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