荧光原位杂交技术（FISH）

简介：

荧光原位杂交（FISH）技术是核酸分子杂交的一种先进方法。通过将已知的荧光标记的单链核酸作为探针，根据碱基互补的原理，经历变性、退火和复性过程，与待检样本中的未知单链核酸特异性结合，形成可以检测的杂交双链核酸。通过荧光显微镜观察和计数荧光信号，从而检测和诊断染色体或基因异常的细胞和组织样本，为各种基因相关疾病的分类、预测和预后提供准确依据。

临床应用：

1、荧光原位杂交技术在肿瘤诊断中扮演重要角色，广泛应用于血液肿瘤学和实体肿瘤学，涵盖了乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌和淋巴癌等实体肿瘤的辅助诊断。目前，FISH主要用于肿瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等方面。
2、荧光原位杂交技术在基因定位方面发挥着关键作用，是该技术最基础、最成功的应用之一。目前，荧光原位杂交技术被广泛用于基因的物理定位和基因图谱的绘制。
3、原位杂交技术在产前检查中发挥关键作用，为产前诊断提供了快捷而可靠的解决方案。通过荧光原位杂交技术，可以在短时间内检测孕妇羊水中的染色体非整倍体，迅速确定胎儿染色体异常疾病。相较于传统方法，这种技术不仅确诊率高达99%，而且缩短了产前诊断的时间，减轻了孕妇的心理负担。

实验原理：

通过使用已知的标记单链核酸作为探针，根据碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸异性结合，形成可检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上呈线性排列，这使得探针能够直接与染色体发生杂交，从而实现特定基因在染色体上的定位。

实验材料准备：

1、实验用具及材料
（1）、人的 MyoD1（MYF3)基因探、人外周血中期染色体细胞标本；
（2）、指甲油、甲酰胺、NaCl 、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20 等；
（3）、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、Nikon E-400 荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200μL移液器、暗盒等。
2、相关溶液的配制
（1）20×SSC：175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠，加水至 1 000 mL（用 10 mol/L NaOH调 pH 至 7.0）。
（2）去离子甲酰胺（DF）：将 10 g 混合床离子交换树脂加入 100 mL 甲酰胺中。电磁搅拌 30 min，用 Whatman l 号滤纸滤。
（3）体积分数 70%甲酰胺/2×SSC：35 mL 甲酰胺，5 mL 20×SSC，10 mL 水。
（4）体积分数 50%甲酰胺/2×SSC：100 mL 甲酰胺，20 mL 20×SSC，80 mL 水。
（5）体积分数 50%硫酸葡聚糖（DS）：65℃水浴中融化，4℃或-20℃保存。
（6）杂交液：8 μL 体积分数 25%DS，20 μL 20×SSC 混合。（或 40 μL 体积分数 50% DS，20 μL 20×SSC，40 μL ddH2O 混合）取上述混合液 50 μL，与 5 μL DF 混合即成。其终浓度为体积分数 10% DS，2×SSC，体积分数 50% DF。
（7）PI/antifade 溶液
PI 原液：先以双蒸水配置溶液，浓度为 100 μg/mL，取出 1 mL，加 39 mL 双蒸水，使终浓度为 2.5 μg/mL。Antifade 原液：以 PBS 缓冲液配制该溶液，使其浓度为 10 mg/mL，用 0.5 mmol/L 的 NaHCO3 调 pH 值为 8.0。取上述溶液 1 mL，加 9 mL 甘油，混匀。PI/antifade 溶液：PI 与 antifade 原液按体积比 1:9 比例充分混匀，－20℃保存备用。
（8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制 1mL/mg DAPI 储存液，按体积比 1:300，以antifade 溶液稀释成工作液。
（9）封闭液 I：体积分数 5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。
（10）封闭液 II：体积分数 5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL 混合。
（11）荧光检测试剂稀释液：体积分数 5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL 混合。
（12）洗脱液：100 mL 20×SSC，加水至 500 mL，加 Tween20 500 μL。

实验步骤：

1.、探针变性
在75℃恒温水浴中，将探针温育5分钟，随后迅速置于0℃，持续5至10分钟，以完成双链DNA探针的变性。
2.、标本变性
（1）将准备好的染色体玻片标本放置于50℃的培养箱中烤片2至3小时。（对经Giemsa染色的标本，在烤片前需先在固定液中进行褪色处理）。
（2）将玻片标本取出，浸泡在70～75℃的70%甲酰胺/2×SSC变性液中，进行2～3分钟的变性处理。
（3）立即按照顺序将标本在70%、90%和100%体积分数的冰乙醇中进行脱水处理，每个浓度持续5分钟，然后进行空气干燥。
3、杂交
取已变性或预退火的DNA探针10μL滴在已变性且脱水的玻片标本上，覆盖18×18盖玻片，用Parafilm密封，放置于37℃的湿暗盒中进行杂交，持续过夜（大约15～17小时）。由于杂交液较少，温度相对较高，而且持续时间较长，为了保持标本的湿润状态，该过程在湿盒中进行。
4、洗脱
执行此步骤有助于去除非特异性结合的探针，有效降低背景信号。
（1）在杂交的第二天，从37℃温箱中取出标本，轻轻使用刀片揭开盖玻片。
（2）将已完成杂交的玻片标本放入预热至42～50℃的50%甲酰胺/2×SSC溶液中，进行3次洗涤，每次5分钟。
（3）在已升温至42～50℃的1×SSC中进行3次洗涤，每次5分钟。
（4）在室温下，轻轻将玻片标本在2×SSC中漂洗一次。
（5）取出玻片，自然干燥。
（6）取200μL的复染溶液（可以是PI/antifade或DAPI/antifade染液），滴在玻片标本上，然后盖上盖玻片。
5、对杂交信号进行放大（适用于使用生物素标记的探针）
（1）在玻片的杂交部位加 150 μL 封闭液 I，用保鲜膜覆盖，37℃温育 20min。
（2）去掉保鲜膜，再加 150 μL avidin-FITC 于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育 40 min。
（3）取出标本，将其放入已预热 42～50℃的洗脱液中洗涤 3 次，每次 5 min。
（4）在玻片标本的杂交部位加 150 μL 封闭液 II，覆盖保鲜膜，37℃温育 20 min。
（5）去掉保鲜膜，加 150 μL antiavidin 于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育 40 min。
（6）取出标本，将其放入已预热 42～50℃的新洗脱液中，洗涤 3 次，每次 5 min。
（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室温清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。
6、封片
可以选择使用不同类型的封片液。如果封片液中没有包含Mowiol（这可促使封片产生自封闭效应），为防止盖片与载玻片之间的溶液挥发，可以使用指甲油在盖玻片周围进行封闭。经封闭的玻片标本可在-20℃至-70℃的冰箱中的暗盒内保存数月。
7.、荧光显微镜观察 FISH 结果
首先，在可见光源下找到显示细胞分裂相的视野，接着启动荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。通过PI染色，细胞呈现红色，而由FITC标记的探针位置则发出绿色荧光。

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