荧光定量PCR实验

简介：

        荧光定量PCR（FQ-PCR），又称TaqMan PCR，是PE公司于1995年推出的核酸定量技术。引入荧光标记的探针，相较于传统PCR，FQ-PCR具有封闭反应、高特异性、灵敏度、对数周期分析、宽广定量范围、在线实时检测、支持多检等优势，操作安全且高效。通过实时监测每个PCR循环的荧光信号，实现对起始模板的实时定量和定性分析。

技术原理：

         PCR反应开始时，荧光信号呈近似直线的基线，可自动生成或手动设定。随后进入指数增长期，曲线高度重复。可在此期间设定荧光阈值线，通常设定在3-15个循环的标准偏差的10倍范围内。当荧光信号达到设定阈值时，对应的循环数即为CT值，与起始浓度的对数呈线性关系，具有良好的重现性。         Ct值用于计算目的基因的表达量，包括绝对定量和相对定量两个概念。绝对定量需使用已知拷贝数的标准品和标准曲线，而相对定量则关注不同样本中目的基因的相对比例，无需了解拷贝数。由于绝对标准品难以获取，实验室通常更倾向于选择相对定量方法计算基因表达量。

实验方法：

 一、特异性荧光标记——探针法：
              在PCR扩增中，引物与特异性荧光探针同时引入。该探针包含报告和淬灭荧光基团，完整时报告信号被淬灭。随着PCR进行，Taq酶切割探针，释放报告基团，产生荧光信号。每扩增一条DNA             链，即形成一个荧光分子，实现了与PCR产物同步的荧光信号累积。 二、非特异性荧光标记——染料法：
              采用SYBR® Green I染料，能与所有双链DNA结合并发出荧光，其信号强度与DNA量成正比，无需复杂的探针设计，经济实惠。然而，由于非特异性扩增和引物二聚体可能导致结果干扰，可以通        过溶解曲线分析来判断产物的特异性，单一峰表示良好的扩增特异性，而双峰可能暗示非特异扩增或引物二聚体。

实验步骤：

    一、主要实验步骤：
               RT-qPCR是由三个步骤组成:
                  1、反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA。
                  2、扩增:用PCR的方法扩增cDNA。
                  3、检测:实时检测和定量扩增的产物。
      二、具体实验步骤：
                 1、设计并合成Realtime PCR引物。
                 2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR®;Green)的PCR反应的优化。
                 3、客户样品RNA抽提。
                           实验对象为组织样品，取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，匀浆后抽提RNA。
                           实验对象为细胞样品，每份样品取1x106~1x107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen)，裂解后抽提RNA。
                  4、RNA质量检测
                           a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度
                           b.使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
                   5、使用逆转录酶(Promega)进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。
                   6、制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
                   7、标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中，进行RealTime PCR扩增和检测。
                   8、检测结果进行标准曲线分析:对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所结果代表某样品的目的基因相对含量。
                   9、提供实验报告:包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表。

结果展示：

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