CHIP染色质免疫共沉淀

简介：

染色质免疫沉淀（ChIP）技术是一项在表观遗传学研究中广泛应用的方法，能够迅速揭示蛋白质与DNA之间的相互作用。
染色质免疫沉淀法（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一项基于抗原抗体反应的技术，通过特异性相互作用，有选择性地富集DNA结合蛋白及其DNA靶标。该方法用于在全基因组水平研究生物体组织或细胞中蛋白质与DNA相互作用的技术。

（图片来源于网络）

技术原理：

在生理条件下，将细胞内的DNA与蛋白质进行交联，然后通过超声或酶处理将染色质切割成小片段。利用抗原抗体的特异性反应，将与目的蛋白结合的DNA片段沉淀。染色质免疫沉淀技术通常包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、反转交联、DNA纯化以及DNA鉴定等步骤。由于CHIP实验涉及多个步骤，其结果的重复性较差，因此需要在每个步骤中设计相应的对照，并对结果进行有经验的分析。

（图片来源于网络）

研究意义：

核酸和蛋白质是构成生命的主要生物大分子，它们之间的相互作用是生命活动的基础，包括生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命过程。研究蛋白质与核酸之间的相互作用是揭示生命现象奥秘的关键，而CHIP检测实验则是探索蛋白质与核酸互作关系的重要工具。

实验材料：

器材：静音混合器、高速低温离心机、超声破碎仪、电泳仪、水平电泳槽、PCR仪、Real-time PCR仪
试剂：HeLa细胞、HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、SDS、NaHCO_3、去氧胆酸钠、EDTA、Tris、蛋白酶抑制剂、蛋白酶 K、Protein A／Gbeads（鲑精DNA）、
对照引物（GAPDH）、阳性对照抗体［乙酰化组蛋白H3抗体（Anti-Acetyl HistoneH3）］、阴性对照抗体［正常家兔IgG（Normal IgG）］、琼脂糖、PCR反应 Mix、SYBR Green qPCR Mix

实验步骤：

基本过程可分为如下几步：
（一）试剂配制
（1）裂解（FA Lysis）缓冲液 50 mmol／L HEPES-KOH,pH 7.5;140mmol/LNaCl; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1％ Triton X-100；0.1％去氧胆酸钠；0.1％SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。
（2）RIPA缓冲液 50 mmol／L Tris-HCI，pH 8.0； 150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA,pH 8.0;1% NP- 40；0.5％去氧胆酸钠；0.1％ SDS；蛋白酶抑制剂（临用前加入）。
（3）漂洗（Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1％ TritonX-100;2 mmol/L EDTA，pH 8.0;150 mmol/L NaCl; 20 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0。
（4）最终漂洗（Final Wash）缓冲液 0.1％ SDS；1% Triton X-100;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;500 mmol/L NaCl;20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。

（二）细胞固定
（1）取一个直径为150毫米的培养皿，其中细胞的汇合度约为80%至90%（例如HeLa细胞数量约为1x107个）。在培养皿中加入20毫升培养基，然后添加550微升37%甲醛（或1100微升18.5%甲醛），以使甲醛的最终浓度达到1%。
（2）温和混匀，室温孵育10 min。
（3）终止交联：加甘氨酸至终浓度为125 mmol／L，温和混匀，室温孵育5 min。
（4）将平皿置于冰上。
（5）吸尽培养基，用20 ml冰冷的PBS清洗细胞。
（6）吸尽PBS，重复清洗细胞1次。
（7）加入2 ml冰冷的PBS（含有1x蛋白酶抑制剂复合物），用细胞刮刀收集细胞，于1.5 ml离心管中。
（8）1000 g、4 ℃，离心5 min。
（9）吸去上清液，加入750 μl FA Lysis缓冲液，重悬细胞，得到细胞裂解液。

（三）染色质断裂
（1）将含有细胞裂解液的离心管放置在冰上，并进行超声破碎。超声功率设定为310瓦，进行20秒的冲击，间隔2秒，总共进行3次超声处理。具体的超声条件可能会因不同的细胞系和细胞数量而有所变化，需要根据实验摸索来确定。在超声处理过程中，超声探头应尽量深入管中，但不要接触到管底或侧壁，以防止产生泡沫。
（2）超声破碎后，10000 g、4 ℃，离心10 min，去除细胞碎片等不溶物质。
（3）吸取上清液分装至新1.5 ml离心管中，每管50 μl（可于-80 ℃保存3个月）。
（4）取100微升超声破碎后的产物，加入5微升蛋白酶K（浓度为20毫克/毫升），在65摄氏度条件下进行旋转混合，并解除交联，持续4至5小时（或过夜）。随后，将一半样品进行酚-氯仿抽提处理，以便进行后续的处理。最终，使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测超声效果.

（四）染色质免疫沉淀
（1）将每管50微升的超声破碎产物稀释至1:10的比例，加入450微升RIPA缓冲液。从中留取5微升（占1%体积）作为Input对照，并将其保存在4摄氏度，以供后续步骤（第4步操作）使用。
（2）在每个样品管中分别加入阳性对照抗体、阴性对照抗体（正常IgG）以及目标蛋白抗体，抗体的用量范围为1至10微克。根据抗体的效力、纯度和特异性，通过梯度稀释抗体，进行实验以确定最适合的抗体用量。
（3）加入20 μl充分混匀的 Protein A／G beads（Salmon Sperm DNA）。
（4）4 ℃，旋转混合，1 h或过夜。
（5）2000 g，离心1 min，弃去上清液。
（6）清洗beads 3次，每次用1 ml Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。
（7）清洗beads 1次，用1 ml Final Wash缓冲液，2000 g离心1 min，弃去上清液。

（五）解交联反应和DNA的纯化
利用蛋白酶K，在65摄氏度条件下保温4至5小时，进行解除交联。接着，通过DNA纯化柱回收DNA，或者选择酚-氯仿抽提的方法，随后通过乙醇沉淀进行DNA的纯化。
（1）每份样品中均加入120 μl Elution 缓冲液（包括Input对照组），30 ℃，旋转混合，15 min。
（2）2000 g离心1 min。
（3）吸取上清液至一新的离心管中，可于-20 ℃保存。
（4）加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋转混匀，解交联4～5 h（或过夜）。
（5）DNA用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，加100 μl水溶解DNA，可于-20 ℃保存。

（六）DNA的鉴定
最常用的DNA鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。

（七）实验结果及分析
（1）交联后的染色质经超声波断裂，2％琼脂糖凝胶电泳分析结果，打断后的染色质片段的平均长度应该在200～1000 bp左右。
（2）纯化后得到的DNA片段经PCR分析，扩增片段为管家基因GAPDH的启动子区，片段大小165 bp，阳性对照和Input对照可见扩增产物，无DNA模板PCR对照无扩增产物，阴性对照可见微弱扩增条带，但与阳性对照比较差别明显。

注意事项：

（1）为了确定甲醛交联的反应时间，需进行预实验，因其在不同细胞类型和数量下会有所不同。若交联时间过长，可能导致实验材料丢失，且超声打断难以有效进行；而过短的交联时间则可能导致不完全的交联。
（2）超声波是通过机械力断裂染色质，容易引起升温或泡沫产生，从而导致蛋白质变性，影响ChIP的效率。在进行超声波断裂染色质时，应在冰上进行，并设计时断时续的超声程序，避免过长的超声时间，以免蛋白质降解。
（3）在ChIP实验中，必须做好实验对照，缺少对照会难以评估实验结果的可靠性。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。同时，进行良好的Input对照，不仅可验证染色质断裂效果，还能根据Input中靶序列的含量和染色质沉淀中靶序列的含量，按照取样比例计算ChIP的效率。
（4）选择染色质免疫沉淀所用的目的蛋白抗体是ChIP实验成功的关键。由于蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能与结合位点过近，无法被抗体识别，影响免疫沉淀复合物在体内有效形成。
因此，并非所有抗体都适用于ChIP实验，只有经过ChIP实验验证的抗体才能确保实验结果的可靠性。

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资料格式：

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