彗星实验（Comet assay）

一、简介

 

彗星实验，又称单细胞凝胶电泳实验，是一种用于评估DNA链损伤程度的技术，最早由Ostling等人在1984年提出。该方法可以有效地检测和量化细胞中DNA单链和双链断裂的程度。彗星实验对低浓度的遗传毒物具有高度敏感性，可用于研究细胞无需处于有丝分裂期，并且只需少量细胞即可进行。

 

图片来源：Bio-Techne

二、实验原理

 

彗星实验，是一种有效评估DNA损伤程度的方法。其基本原理是，在处理器官或组织后（如辐射或重金属暴露），细胞内的DNA可能会出现单链或双链断裂。在细胞裂解后，DNA会解旋并迁移出核，然后在电场的作用下形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的DNA在电场作用下会迁移较短的距离，保持在核内，形成圆形或轻微拖尾的图谱。

 

根据电泳缓冲液的pH值，彗星实验可分为中性（pH=8.4）和碱性（pH＞13）两种类型。中性实验主要用于检测DNA双链断裂，而碱性实验则更为敏感，可检测到更少量的单链和双链断裂。

 

在进行实验时，样品准备、电泳条件、视觉分析参数（如染色强度、显微镜光强度）以及环境条件（如背景照明）等方面都需要仔细控制，因为它们可能会影响到DNA的迁移。

 

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三、用途

 

评价单个细胞的 DNA 损伤(各种因素的生物反应、肿瘤的研究治疗预测)

 

四、实验步骤

 

1.单细胞悬液制备：

- 使用胰酶消化细胞至离心管中，并进行细胞计数。

- 使用PBS调节细胞密度至每毫升105~106个。

 

2.制胶：

- 在预热的载玻片上滴加第一层0.5%正常熔点琼脂糖，然后迅速盖上干净的盖玻片，置于4°C静置10分钟使其凝固。

- 准备混合液，将10微升含有10000个细胞的PBS和75微升10.5%低熔点琼脂糖在37°C混匀，然后轻轻揭去盖玻片，将含有细胞的低熔点琼脂糖滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，再次置于4°C静置10分钟使其凝固。第三层胶的制备与第一层相同，然后再次盖上盖玻片。

 

3. 裂解：

- 移除盖玻片，将载玻片浸入新配置的RIPA细胞裂解液中，至少裂解2.5小时（尽量使每张玻片裂解时间相同）。此步骤的目的是通过去垢剂和高盐溶液除去溶解细胞膜和核膜，除去蛋白质、RNA等，仅留下核骨架。

 

4.解旋和电泳：

- 细胞裂解后，取出载玻片，用PBS冲洗2次，然后将载玻片置于水平电泳槽中。

- 倒入1XTBE电泳缓冲液，覆盖胶面0.25厘米，进行碱解旋20分钟，然后在4°C冰箱中电泳25~30分钟，电压设置为25V。

 

5. 染色：

- 将载玻片取出，用滤纸吸干电泳缓冲液，然后用Tris-HCl(pH 7.5)中和15分钟。

- 然后在每片载玻片上滴加50微升30ug/mL的溴化乙锭(EB)溶液，进行避光操作。

- 盖上盖玻片，避光染色20分钟。

 

6. 镜检核图像分析：

- 尽快将EB染色后的样本放置在荧光显微镜下观察，并拍摄电泳图谱的图像。

 

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五、注意事项

 

1.细胞密度控制： 细胞需要被准确计数，以确保每张凝胶上的细胞密度为1×10^4个/ml。密度过大会导致软件分析困难，而密度过小则会增加工作量，因为单个视野下的细胞数量较少。

 

2.凝胶制备： 无论是采用2层凝胶法还是3层凝胶法，都必须严防脱胶的发生，以保证凝胶的完整性和稳定性。

 

3.试剂配制和操作一致性： 在细胞裂解、解旋、电泳、中和和染色等步骤中，必须精确配制试剂。所有实验组所使用的试剂和操作时间必须完全一致，以确保实验结果的客观性和可比性，避免产生偏差。

 

誉嘉生物可提供“彗星实验（Comet assay）”

                                                                      

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