免疫组化实验

简介：

      免疫组化（IHC）是一种通过应用抗原抗体的高度特异性结合以及显色反应的实验手段，用于对组织细胞内抗原进行定位、定性和相对定量的研究。
      该技术利用抗体与抗原之间的高度特异性结合原理，首先使用抗体与组织或细胞中的目标蛋白特异性结合，然后通过化学方法将抗体结合的位置可视化，从而实现对组织或细胞中未知抗原的定性、定位或定量研究。

应用范围：

      免疫组织技术在临床病理学的诊断中扮演着关键角色，尤其在解决疑难病例、进行诊断和鉴别工作方面具有显著意义。该技术的应用领域广泛，包括但不限于：确诊和区分肿瘤类型、确定肿瘤的原发位置、深入分析组织的病理学分类、对组织进行分类，以及通过免疫组织化学研究利用多种标志物进行软组织肿瘤的准确定性诊断，甚至可以发现微小转移灶等。
在科研领域中，免疫组织技术不仅可以用于鉴定组织形态，还可用于检测靶标的细胞和亚细胞结构的定位，以及观察蛋白表达的丰度等方面。

检测对象：

      该技术主要用于处理组织标本，包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片以及漂片。其中，石蜡切片是免疫组化中最为普遍和基础的一种，因为它能够保持组织形态的完整性，支持连续切片，有利于进行多指标染色的对照观察，并能够长时间保存。
      然而，制作石蜡切片的过程中，蛋白质可能因为固定而发生相互交联，从而影响抗原抗体的结合。为减轻这一影响，需要进行抗原修复的步骤。

实验步骤：

具体步骤(石蜡切片)：
1）、石蜡切片脱蜡至水：
依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ 10min——环保型脱蜡液Ⅱ 10min——环保型脱蜡液Ⅲ 10min——无水乙醇Ⅰ 5min——无水乙醇Ⅱ 5min——无水乙醇Ⅲ 5min——蒸馏水洗。

2）、抗原修复：
将切片浸没在盛满1×柠檬酸抗原修复液（pH 6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min、停火8min、中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3）、阻断内源性过氧化酶：将切片放入3%双氧  水溶液，室温避光孵育25min。将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4）、画圈：切片甩干后，组化笔在组织周围画圈。

5）、血清封闭：滴加3% BSA牛血清白蛋白，封闭30min。

6）、加一抗：轻轻甩掉封闭液，滴加稀释好的一抗，平放于湿盒内4℃孵育过夜。

7）、加二抗：将切片浸没在置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加对应的HRP标记的二抗，室温孵育50min。

8）、DAB显色：将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察，出现适宜棕黄色阳性，用水冲洗终止显色。

9）、复染细胞核：将切片放入苏木素染液复染3min左右，用水冲洗，接着用苏木素分化液分化数秒，用水冲洗，最后用苏木素返蓝液进行返蓝，用水冲洗。

10）、脱水封片：依次将切片放入无水乙醇Ⅰ5min——无水乙醇Ⅱ 5min——无水乙醇Ⅲ 5min——无水乙醇Ⅳ 5min——环保型脱蜡液 5min，拿出来晾干，用中性树胶封片。

结果分析：

正常的结果应该是：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。

图源网络

      结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
免疫组化结果分析：
1）、对照染色：与实验中设立对照组类似，免疫组化也必须进行对照染色，缺乏对照的结果不可靠。通常包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照和自身对照，其中一个阳性组织和一个阴性组织对照足够。

2）、定位：抗原表达应在特定部位，例如，LCA应定位在细胞膜上，CK应在细胞浆内，PCNA和p53蛋白应在细胞核内。未在抗原所在部位呈阳性着色不能视为确切阳性结果，可能是非特异性染色或假阳性。若存在不确定性，需使用上述提到的对照染色。

3）、半定量：现今通常使用图像分析系统进行定量，但如果实验室条件有限，可使用肉眼进行半定量评估。免疫组化的半定量通常分为三级：弱（+）、中（++）、强（+++）。观察5-10个高倍视野（HPF），根据弱（+）=1、中（++）=2、强（+++）=3进行评分。通过计算（+）% × 1 +（++）% × 2 +（+++）% × 3得出数值，总值<1.0为（+），1.0-1.5为（++），>1.5为（+++）。

图源网络

4）、图像分析仪：进行精确定量需要使用图像分析仪，有多种类型可选择。推荐一款免费软件：Image J，该软件简洁易用，可满足一般免疫组化结果分析需求。

图源网络

常见问题及建议：

常见的非特异性染色：

图源网络

1）、抗体问题：一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

2）、抗体浓度过高/孵育时间过长：每次使用新抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。

3）、DAB染色时间太长/变质：DAB的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。

4）、内源性酶和生物素：内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。处理的办法为：灭活碱性磷酸酶

5）、组织变干：一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。

图源网络

6）、浸泡时间过长：切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜。

7）、清洗不充分：清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH值。

8）、封闭血清问题：原则是选择二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。