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WB实验 问题条带出现的原因?附解决方法
人阅读 发布时间:2024-01-05 17:51
材料与仪器:
蛋白样品、抗体。
步骤:
(1)、杂交信号很弱,条带浅,如下图
原因及对策:
1、蛋白量太少,可以适当增加蛋白上样量;
2、 抗体效价太低,可以适当加大抗体浓度;
3、过度漂洗膜,也可能会导致信号变弱、条带太浅;
4、转移到膜上的蛋白太少,当蛋白分子量 <10 KD 时,可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。
(2)、条带上有单个或多个白点
原因及对策:「三明治」结构不紧凑导致,夹板做「三明治」结构时要确保膜和胶块之间没有气泡。
(3)、出现「微笑」或「倒微笑」条带
原因及对策:
1、凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓;
2、分离胶凝固时可用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面,阻断空气,分隔线会更加平直,也会减少“微笑”或“倒微笑”条带的出现;
3、胶板底部有气泡会影响电泳效果,开始电泳前应倾斜电泳装置,赶走气泡。
(4)、出现非特异带
原因及对策:
1、一抗不是唯 一特异的,选择抗体时应注意看其说明书中是否有提示非特异性条带;
2、二抗出现非特异结合,可以设立不加一抗,只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合。
(5)、膜的背景太高
原因及对策:
1、膜没有均匀浸湿,转膜前用 100% 甲醇将膜完全浸湿;
2、抗体浓度过高,杂交前检测一抗、二抗的最适浓度;
3、使用的封闭液浓度不适于杂交,多次实验找到最适封闭液浓度;
4、洗涤不充分,可增加洗涤次数。
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